Ινδοί επιστήμονες κατασκεύασαν καινοτόμο πρόγραμμα επεξεργασίας γονιδίων

Επιστήμονες από το CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology ανέπτυξαν ένα βελτιωμένο σύστημα επεξεργασίας γονιδιώματος που μπορεί να τροποποιήσει το DNA με μεγαλύτερη ακρίβεια και αποτελεσματικότητα από τις υπάρχουσες τεχνολογίες που βασίζονται στο CRISPR.

Το CRISPR εμφανίζεται φυσικά σε ορισμένα βακτήρια, ως μέρος του ανοσοποιητικού τους συστήματος που περιορίζει τις λοιμώξεις αναγνωρίζοντας και καταστρέφοντας το DNA του ιού. Στη βραβευμένη με Νόμπελ εργασία, οι επιστήμονες επαναχρησιμοποίησαν αυτόν τον βακτηριακό αμυντικό μηχανισμό για να αναπτύξουν μια νέα προσέγγιση για την επεξεργασία των γονιδιωμάτων των οργανισμών ανώτερης τάξης.

Το πρόβλημα εκτός στόχου του CRISPR

Σήμερα, χρησιμοποιώντας το CRISPR-Cas9, οι ερευνητές μπορούν να προσθέσουν, να αφαιρέσουν ή να αλλάξουν συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA στο γονιδίωμα των ζώων. Αυτό το σύστημα έχει χρησιμοποιηθεί σε διάφορους τομείς, συμπεριλαμβανομένης της γεωργίας — για τη βελτίωση της θρεπτικής αξίας των φυτών και την αύξηση της απόδοσης — και στην υγειονομική περίθαλψη για τη διάγνωση αρκετών ασθενειών και τη θεραπεία γενετικών διαταραχών .

Το εργαλείο επεξεργασίας γονιδίων CRISPR-Cas9 χρησιμοποιεί έναν οδηγό-RNA (gRNA) που έχει σχεδιαστεί για να βρίσκει και να συνδέεται με ένα συγκεκριμένο τμήμα του γονιδιώματος στόχου. Το gRNA κατευθύνει ένα ένζυμο, το Cas9, στη θέση στόχο, το οποίο ακολουθείται από μια σύντομη αλληλουχία DNA που ονομάζεται γειτονικό μοτίβο πρωτοδιαχωριστή (PAM). Το Cas9 αναγνωρίζει και συνδέεται με την αλληλουχία PAM και λειτουργεί ως μοριακό ψαλίδι που κόβει κάποιο κατεστραμμένο DNA. Αυτό ενεργοποιεί αυτόματα το σύστημα επιδιόρθωσης DNA του κυττάρου, το οποίο επισκευάζει το κομμένο τμήμα για να εισαγάγει τη σωστή αλληλουχία DNA.

Αλλά το σύστημα CRISPR-Cas9 μπορεί επίσης να αναγνωρίσει και να κόψει μέρη του γονιδιώματος εκτός από το προβλεπόμενο τμήμα. Τέτοιες επιδράσεις «εκτός στόχου» είναι πιο συνηθισμένες όταν χρησιμοποιείται το ένζυμο SpCas9 που προέρχεται από βακτήρια Streptococcus pyogenes . Οι επιστήμονες μπόρεσαν να κατασκευάσουν εκδόσεις του SpCas9 με υψηλότερη πιστότητα αλλά μόνο με το κόστος της αποτελεσματικότητας της επεξεργασίας.

Εναλλαγή SpCas9 με FnCas9

Για να ξεπεράσουν αυτά τα ζητήματα, οι ερευνητές διερευνούν τα ένζυμα Cas9 από τα βακτήρια Francisella novicida . Ενώ αυτό το Cas9, που ονομάζεται FnCas9, είναι πολύ ακριβές, έχει επίσης χαμηλή απόδοση.

Για να το βελτιώσουν χωρίς να διακυβεύσουν την ιδιαιτερότητά του, οι ερευνητές με επικεφαλής τον Debojyoti Chakraborty και τον Souvik Maiti στο CSIR-IGIB τροποποίησαν και κατασκεύασαν νέες εκδόσεις του FnCas9 .

Οι ερευνητές χρησιμοποίησαν αμινοξέα στο FnCas9 που αναγνωρίζουν και αλληλεπιδρούν με την αλληλουχία PAM στο γονιδίωμα του ξενιστή. «Κάνοντας αυτό, αυξάνουμε τη συγγένεια δέσμευσης της πρωτεΐνης Cas με την αλληλουχία PAM», είπε ο Δρ Chakraborty. «Το Cas9 μπορεί στη συνέχεια να καθίσει στο DNA σε μια ισχυρότερη διαμόρφωση και η επεξεργασία των γονιδίων σας γίνεται πολύ πιο αποτελεσματική».

Οι ερευνητές κατασκεύασαν επίσης το βελτιωμένο FnCas9 ώστε να είναι πιο ευέλικτο και να επεξεργάζονται περιοχές του γονιδιώματος που κατά τα άλλα είναι πιο δύσκολο να προσπελαστούν. «Αυτό ανοίγει περισσότερους δρόμους για γονιδιακή επεξεργασία», είπε ο Δρ. Chakraborty.

Αποχυμοποίηση του ενζύμου

Πειράματα για τη μέτρηση της ενζυμικής δραστηριότητας έδειξαν ότι το ενισχυμένο FnCas9 έκοψε το DNA στόχο με υψηλότερο ρυθμό σε σύγκριση με το μη τροποποιημένο FnCas9.

Τα εργαλεία που βασίζονται στο CRISPR για διαγνωστικά και θεραπευτικά βασίζονται στην ικανότητα του συστήματος να αναγνωρίζει συγκεκριμένες μονονουκλεοτιδικές αλλαγές στο DNA. Τα νουκλεοτίδια είναι τα δομικά στοιχεία του DNA και του RNA. Κάθε νουκλεοτίδιο αποτελείται από μια νουκλεοβάση, μια φωσφορική ομάδα και ένα σάκχαρο. Κάθε νουκλεοτίδιο στο DNA έχει μία από τις τέσσερις νουκλεοβάσεις: αδενοσίνη, θυμίνη, γουανίνη και κυτοσίνη. Μια αλλαγή ενός νουκλεοτιδίου είναι όταν μόνο ένα νουκλεοτίδιο στο γονιδίωμα χρειάζεται να «επισκευαστεί».

Όταν οι ερευνητές εξέτασαν την ικανότητα του ενισχυμένου FnCas9 να αναγνωρίζει τέτοιες αλλαγές στο γονιδίωμα, διαπίστωσαν ότι το enFnCas9 είχε καλύτερη απόδοση από το μη τροποποιημένο FnCas9. Ένα βελτιωμένο διαγνωστικό που βασίζεται στο FnCas9 θα μπορούσε να στοχεύσει σχεδόν τον διπλάσιο αριθμό αλλαγών σε σύγκριση με το FnCas9, αυξάνοντας το εύρος της ανίχνευσης περισσότερων γενετικών αλλαγών που προκαλούν ασθένειες.

Δοκιμές ενάντια σε μια κληρονομική τύφλωση

Μόλις η ομάδα του Δρ. Chakraborty είχε δείξει την αυξημένη αποτελεσματικότητα και δραστηριότητα του ενισχυμένου ενζύμου FnCas9, μια ομάδα με επικεφαλής τον Indumathi Mariappan στο LV Prasad Eye Institute στο Hyderabad διερεύνησε την καταλληλότητα του ενζύμου για θεραπευτικές εφαρμογές.

Οι ερευνητές χρησιμοποίησαν ενισχυμένο FnCas9 για να επεξεργαστούν το γονιδίωμα των ανθρώπινων νεφρών και των οφθαλμικών κυττάρων που αναπτύσσονται σε πιάτα εργαστηρίου. Όχι μόνο επεξεργάστηκε τα γονίδια σε αυτά τα κύτταρα με καλύτερο ρυθμό από το SpCas9, αλλά έδειξε επίσης αμελητέα αποτελέσματα εκτός στόχου.

Η ομάδα τελικά προσπάθησε να καταλάβει εάν το ενισχυμένο FnCas9 είναι μια βιώσιμη επιλογή για τη θεραπεία γενετικών διαταραχών. Εξέτασαν την αποτελεσματικότητα του ενζύμου στη διόρθωση μιας γενετικής μετάλλαξης που προκαλεί τη συγγενή αμαύρωση Leber τύπου 2 (LCA2), μια μορφή κληρονομικής τύφλωσης. Μία μόνο μετάλλαξη στο γονίδιο RPE65 έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της έκφρασης μιας πρωτεΐνης που ονομάζεται επιθηλιακή-ειδική για την χρωστική του αμφιβληστροειδούς (RPE65), με αποτέλεσμα σοβαρή απώλεια όρασης

Μια εκπληκτική αποτελεσματικότητα

Η ομάδα απομόνωσε κύτταρα δέρματος από ένα άτομο με LCA2 που φέρει τη μετάλλαξη RPE65 και επαναπρογραμμάτισε αυτά τα κύτταρα για να γίνουν επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs). Τέτοια κύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν σε οποιονδήποτε τύπο κυττάρου στο ανθρώπινο σώμα. Όταν οι ερευνητές διαφοροποίησαν τα iPSC σε κύτταρα του αμφιβληστροειδούς του ματιού, τα κύτταρα εξέφρασαν αμελητέα επίπεδα πρωτεΐνης RPE65.

Οι ερευνητές παρέδωσαν ένα σύστημα CRISPR με το ενισχυμένο ένζυμο FnCas9 στα iPSC του ατόμου για να διορθώσουν τη μετάλλαξη που ευθύνεται για τα χαμηλά επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης. Όταν ανέλυσαν την αλληλουχία των επεξεργασμένων κυττάρων, διαπίστωσαν ότι το εργαλείο CRISPR είχε διορθώσει τη μετάλλαξη. Τα επεξεργασμένα iPSC όταν διαφοροποιήθηκαν σε κύτταρα αμφιβληστροειδούς εμφάνισαν επίσης φυσιολογικά επίπεδα της πρωτεΐνης RPE65.

Ο Δρ Mariappan είπε ότι η ομάδα έμεινε έκπληκτη από την αποτελεσματικότητα της επεξεργασίας. Τα περισσότερα από τα iPSC έφεραν τις επεξεργασίες και όταν οι ερευνητές μεγάλωσαν αποικίες από μεμονωμένα επεξεργασμένα iPSC, διαπίστωσαν ότι δύο αποικίες παρουσίασαν 100% διόρθωση μετάλλαξης.

«Εξετάσαμε επίσης ολόκληρο το γονιδίωμα για αλληλεπιδράσεις εκτός στόχου και βρήκαμε μόνο μερικές, χωρίς ιδιαίτερη ανησυχία, σε σύγκριση με αρκετές επιτυχίες που παρατηρήθηκαν με άλλες πρωτεΐνες Cas9 [που εξετάσαμε]», πρόσθεσε.

Τι χρειαζόταν η ερευνητική κοινότητα

Προηγούμενες αναφορές έχουν προτείνει ότι τέτοια κύτταρα αμφιβληστροειδούς ειδικά για κάθε άτομο μπορούν να μεταμοσχευθούν ξανά σε ένα άτομο για τη θεραπεία παθήσεων κληρονομικής τύφλωσης όπως το LCA2.

Μια ομάδα αμερικανών ερευνητών ανέφερε στις 6 Μαΐου 2024 , στο New England Journal of Medicine ότι το CRISPR με ένεση απευθείας στα μάτια των ατόμων που πάσχουν από LCA2 έδειξε επιτυχία σε πρώιμες κλινικές δοκιμές. Ωστόσο, η επεξεργασία βλαστικών κυττάρων ειδικά για τον ασθενή και η μεταμόσχευση των διορθωμένων με μετάλλαξη κυττάρων σε ασθενείς είναι μια ασφαλέστερη επιλογή, σύμφωνα με τον Δρ Mariappan, «επειδή αυτό μας επιτρέπει να εξετάσουμε και να επιβεβαιώσουμε ακριβείς τροποποιήσεις».

«Η ερευνητική κοινότητα χρειαζόταν αυτή την ακρίβεια» στο σύστημα CRISPR, είπε η Shailja Singh, ερευνήτρια στο Πανεπιστήμιο Jawaharlal Nehru του Νέου Δελχί, η οποία χρησιμοποιεί εργαλεία βασισμένα στο CRISPR για να μοντελοποιήσει και να μελετήσει γενετικές ασθένειες όπως η δρεπανοκυτταρική αναιμία και η β-θαλασσαιμία. Τέτοιες μειωμένες επιδράσεις εκτός στόχου είναι κρίσιμες για όσους χρησιμοποιούν θεραπεία με βάση το CRISPR για τη διόρθωση μεταλλάξεων, «άρα αυτή είναι μια πολύ ευπρόσδεκτη προσέγγιση».

Ο Δρ Singh πρόσθεσε ότι ενώ ένα ακριβές ένζυμο χωρίς αποτελέσματα εκτός στόχου είναι πολύ απαραίτητο, το σύστημα χορήγησης πρέπει επίσης να είναι εξίσου ικανό. Σύμφωνα με αυτήν, οι ερευνητές θα πρέπει στη συνέχεια να επικεντρωθούν στην ακριβή παροχή αυτού του εργαλείου στους πυρήνες των κυττάρων-στόχων

Κάνοντας θεραπείες για την Ινδία

Ο Δρ. Chakraborty είπε ότι η ομάδα εργάζεται για την προσαρμογή του συστήματος σε διαφορετικές μεθόδους παράδοσης καθώς και για τη μείωση του μεγέθους του enFnCas9. «Όλα αυτά θα έρθουν στις επόμενες μελέτες», είπε.

Η ομάδα βρίσκεται επίσης σε επαφή με ορισμένες ινδικές εταιρείες για την επέκταση και την κατασκευή θεραπευτικών λύσεων για πολλαπλές γενετικές διαταραχές. «Αυτό ανοίγει τις πόρτες για μη αδειοδότηση από ξένη οντότητα, κάτι που θα μπορούσε να είναι πολύ, πολύ ακριβό».

Ο Δρ Mariappan συμφώνησε: «Με την ιθαγενή πνευματική ιδιοκτησία για έναν εκδότη τόσο υψηλής ακρίβειας, είμαστε τώρα σε καλύτερη θέση να αναπτύξουμε νεότερες θεραπείες με προσιτό κόστος για άτομα σε χώρες χαμηλού και μεσαίου εισοδήματος όπως η δική μας».